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      DNA合成



      DNA合成



      隨著納米技術、生物技術、化學生物學、分子生物學等多學科的交叉融合,利用DNA對納米材料或是分子進行功能化修飾對于化學研究者而言可以說已經是較為成熟的技術。對于涉及生物醫學領域的研究者來說,設計引物更是必須打牢的基本功。對于科研工作者而言,去定制合成一段DNA序列只需要坐在電腦前輸入想要的序列,選定購買的量與純化方式,然后等著實際上送上門就好。DNA的定制合成看上去極其普通平常,都不如點個外賣來的讓人糾結(甚至有時價格比一頓外賣還便宜),但是據Nature 的一篇報道 [1],這看上去歲月靜好波瀾不驚的表面下,新的技術革新正在洶涌澎湃,也許將改變未來科研的面貌。

      國內一家大型專業DNA定制合成公司的定制界面,定制DNA可能比叫外賣還快。


      為了能夠理解這一變革,我們先要了解當前生物公司是怎樣合成DNA的。根據各大公司的技術資料顯示,目前廣泛采用的是一種20世紀80年代開發的被稱為“固相亞磷酰胺合成法”的化學合成法。其過程主要包括脫三苯甲基(detritylation)—激活(activation)—偶聯(coupling)—加帽(capping)—氧化(oxidation)—脫三苯甲基(detritylation)依次循環,一次循環添加一個堿基,每個堿基都被一個保護基團封端,該保護基團阻止其反應延伸鏈,直到該封端被移除并添加下一個堿基。由于在固相上進行反應,每添加一個堿基就通過將多余的反應物洗去來控制反應的進程,很容易實現自動化,所以該方法很快就被各大公司采納,開發了專用的DNA自動化合成儀。

      DNA化學合成法的技術流程。圖片來源:ATDBio


      化學合成的常識告訴我們,既然每添加一個堿基需要這么多的步驟,合成的效率就是必須關注的問題。經過了接近40年的發展,通過使用品質優良的原料以及對生產工藝的優化,每一步添加堿基的成功率已經能夠達到99.5%。但是每個加堿基循環0.5%的失敗率不容忽視,尤其是這失敗率是疊加的,當要合成一段60個堿基的DNA時,成功率就只有74.0%。這就是為什么很多生物公司合成的DNA長度越長,單堿基的費率就越高,且大多不提供超過200個堿基的DNA合成服務,因為其理論成功率不會高于37%,而實際操作中因為各種不可控的因素,幾乎無法成功得到想要的DNA分子,這也就是為什么我們很難找到公司愿意合成多于200個堿基的單鏈DNA。因此,DNA化學合成的致命缺點就是難以合成長鏈的DNA分子。


      當化學方法無能為力時,不少人就想到了“師法自然”,畢竟人類基因組中30億個堿基對不是天上掉下來的。得益于酶學的發展,核酸擴增技術的發展使DNA、RNA的檢測早已不是難題,那么這次生物酶是否能幫助人類完成對DNA的定制合成呢?答案當然是肯定的。


      從2018年下半年開始,與DNA的生物合成進展相關新聞頻繁出現,很多頂尖研究機構、生物技術巨頭參與其中。6月,美國哈佛大學George Church課題組在預印本網站bioRxiv網站上傳了一項研究成果 [2],利用模板非依賴性的DNA聚合酶實現DNA的定制化合成,成功合成長度為144個堿基的DNA。兩個月后,總部位于美國加州的生物技術公司Molecular Assemblies宣布利用與Church相似的技術取得了DNA生物合成的突破。7月,加州大學伯克利分校的Jay Keasling生物合成實驗室發表了一篇Nature Biotechnology[3],利用模板非依賴性的DNA聚合酶實現DNA的從頭合成(De novo synthesis),且每添加一個堿基耗時10-20 s,并很快宣布與Ansa Biotechnologies展開合作推廣該技術的商業化。10月,法國巴黎的生物技術公司DNA Script宣布成果利用生物酶合成法定制合成了150個堿基的DNA分子,并且測序顯示成功率“讓人非常滿意”。很快,英國劍橋的兩家公司,Nuclera Nucleics 與Evonetix,也公布了相關計劃,開發DNA生物合成技術。目前為止尚未有國內生物技術公司公布該領域的研究計劃。

      末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)的結構。圖片來源:J. Mol. Biol. [4]


      基于TdT的DNA生物合成方法示意圖。圖片來源:Nat. Biotechnol. [3]


      以上所有技術的核心就是來源于免疫細胞的一種稱為末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)的DNA聚合酶。與大多數DNA聚合酶不同,TdT可以在沒有模板的情況下工作,在DNA分子的末端隨機添加新的堿基。該技術的難點就是怎么解決“隨機”添加堿基的問題,讓每次都添加上需要添加的堿基。在這個問題上,不同的研究組選擇了不同的思路。Ansa Biotechnologies選擇將每個要添加的堿基連接在TdT上,這樣每次添加一個堿基后TdT就被共價結合在DNA的3’末端,使TdT無法再繼續隨機添加堿基,然后再通過剪切、洗去、再添加的方法依次合成。而其它大部分研究組則選擇利用生物技術改在TdT酶,或者對修飾堿基單體進行修飾,使每添加一個堿基后反應能夠自然停止,直到加入新的反應物。


      顯然,用生物合成的方法來定制DNA仍然處于起始階段——擁有多年DNA合成經驗的巨頭們都在合成策略上有所分歧。但是這是一個巨大的市場,因為DNA的生物合成一旦實現,將極大拓展DNA分子的應用范圍。目前DNA化學合成的市場大約每年10億美元,而一旦能夠合成更長鏈的DNA,將使市場拓展到生物信息儲存領域,產生140億美元的潛在增長。更重要的是,該技術將推動合成生物學的進步,使人類能夠設計與構建基因組數據庫,生命科學研究可能將從改造發展到創造。雖然目前DNA的生物合成不論是準確度、速度、還是合成長度都還無法比肩化學合成,但是我們無法預估它的未來——就像我們不能小瞧任何一個襁褓中的嬰兒一樣。


      參考文獻:

      1. The race for enzymatic DNA synthesis heats up. Nature2019566, 565, DOI: 10.1038/d41586-019-00682-0

      https://www.nature.com/articles/d41586-019-00682-0

      2. Enzymatic DNA synthesis for digital information storage. Preprint at bioRxiv, DOI: 10.1101/348987

      https://www.biorxiv.org/content/10.1101/348987v1

      3. De novo DNA synthesis using polymerase-nucleotide conjugates. Nat. Biotechnol., 201836, 645-650, DOI: 10.1038/nbt.4173

      https://www.nature.com/articles/nbt.4173

      4. J. Mol. Biol., 2013425, 4334–4352, DOI:

      https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022283613004415



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